Рекомендації щодо проведення ІФА
Коректне проведення імуноферментного аналізу досягається при обов’язковому виконанні наступних вимог:
- Якісна підготовка посуду та дистильованої води
- Правильна підготовка досліджуваного матеріалу.
- Правильна робота з автоматичною піпеткою.
- Дотримання пунктів інструкції до тест-системи та умов проведення ІФА:
- дотримання температурного режиму та часу інкубації
- якісне промивання планшету на всіх етапах проведення ІФА
- точність роботи обладнання - піпеток, промивачів, термостатів та спектрофотометрів
Рекомендації щодо якісної підготовки посуду для ІФА
- Рис.1. Окремі ємкості для різних реагентів
Посуд необхідно мити, використовуючи рідкі засоби для миття, які не містять біодобавок. Після миття ретельно ополіскувати посуд проточною, а потім дистильованою водою. Необхідно обов’язково виділяти різні ємкості для роботи з розчинами кон’югатів і проявників (рис. 1). Для маніпуляцій з розчинами кон’югатів та проявників необхідно використовувати одноразові наконечники.
Рекомендації по підготовці досліджуваних зразків
Перед дослідженням в ІФА сироватку можна зберігати протягом 72 годин в холодильнику при 2-80С. Якщо немає можливості дослідити сироватки або плазму протягом зазначеного часу, їх необхідно заморозити при температурі -200С або нижчій.
Зразки сироваток мають бути прозорими, без ознак гемолізу, вираженої гіперліпідемії та бактеріємії.
Для отримання коректного результату при дослідженні сироваток в динаміці захворювання необхідно створити банк сироваток первинного забору, заморожуючи їх при -200С або нижче.
Умови проведення ІФА
- Рис. 2. Заповнення протоколу дослідження
При постановці аналізу температра в приміщенні лабораторії повинна становити 18-250С.
Не допускається наявність в лабораторії парів будь-яких окиснювачів (відкритих ємкостей з розчинами пероксиду водню, гіпохлориду та ін.) та хлорвмісних розчинів.
В процесі проведення ІФА необхідно використовувати якісну дистильовану воду, яка зберігається не довше двох діб.
Недопустимим є повторне використання планшетів тест-систем для будь-якої іншої роботи.
Якісна робота діагностичних наборів гаратнована лише в межах зазначеного терміну придатності за умови дотримання вказаних умов зберігання тест-наборів.
Необхідно обмежити потрапляння прямих сонячних променів на лунки планшету.
Перед початком проведення аналізу необхідно заповнити протокол дослідження (рис. 2)
Якщо при внесенні досліджуваного зразка сталася помилка, наприклад, дві сироватки внесли в одну лунку, таку лунку забраковують. При цьому в схемі внесення зразків необхідно зробити помітку, яка саме лунка містить брак. Час заповнення всіх необхідних лунок не повинен перевищувати 15-20 хв.
Дотримання температурного режиму та часу інкубації
Інкубацію планшету на всіх етапах ІФА проводять при температурі, вказаній в інструкції, при цьому кімнатною вважається температура 18-250С.
Не інкубуйте планшети в термостаті, встановлюючи їх один на один, оскільки нерівномірне прогрівання планшету в цьому випадку призведе до появи крайового ефекту - підвищеного фону по периметру планшету (рис. 3, 4).
|
|
Основні правила роботи з автоматичною піпеткою
- Встановіть необхідний об’єм, як зазначено в інструкції до піпетки.
- Переконайтеся, що наконечник чистий, а всередині в ньому відсутні посторонні частки; щільно надіньте його на конус піпетки.
- Під час роботи тримайте піпетку вертикально (рис. 5).
- Великий палець руки повинен лежати на операційній кнопці піпетки.
- Рис. 5. Правильне і неправильне положення піпетки
Занурте наконечник на 2-3 мм в біологічну рідину і натисніть на операційну кнопку до першого упору. Не виймаючи наконечник з рідини, обережно відпустіть кнопку в початкове положення. Занурте наконечник на 2-3 мм в розчин, куди необхідно перенести набрану рідину, натисніть кнопку до першого упору. Не змінюючи положення піпетки, плавно відпустіть кнопку до початкового положення. Таким чином наконечник заповниться для перемішування. Повторіть цю процедуру 2-3 рази. Потім натисніть операційну кнопку до другого упору для повного звільнення від рідини. Вийміть наконечник з розчину і відпустіть операційну кнопку до початкового положення. Зніміть наконечник з піпетки за допомогою механізму для зняття наконечників. Замініть наконечник і продовжуйте роботу з наступним зразком біологічної рідини.
Для кращого контролю за внесенням компонентів планшет бажано ставити на білий фон.
При роботі з восьмиканальною піпеткою варто звертати увагу на рівномірність заповнення рідиною всіх наконечників піпетки.
Контрольні і дослідні зразки вносити необхідно обережно, піпетуючи суміш в лунках, при цьому наконечник не повинен торкатися дна лунки.
Промивання планшету
Якісне промивання планшету - один із визначних факторів при проведенні імуноферментного аналізу.
Режим промивання повинен строго відповідати вимогам інструкції. Необхідно слідкувати за рівномірним заповненням всіх лунок планшету, а також звертати увагу, щоб не було перетікання промиваючого розчину з однієї лунки в іншу.
Час експозиції планшету з промиваючим розчином на кожному етапі промивання повинно становити не менше 30 секунд, якщо немає додаткових вимог в інструкції.
Для попередження забруднення промивача (вошера) необхідно щоденно промивати його дистильованою водою, а щотижня - 30% розчином етилового спирту.
Найчастіша причина помилок - забруднення каналів промивача або простору між голками шматочками марлі, вати або кристалами солей.
Розчин проявника безпосередньо перед використанням повинен бути прозорим і безбарвним. Залишки розчину у ванночці рекомендують не виливати до закінчення інкубації планшету з проявником. Проявник, який залишився в ванночці, не повинен змінювати колір протягом 30 хв; поява забарвлення розчину проявника свідчить про його забруднення.
Дуже важливим фактором, який впливає на проведення ІФА і дає можливість отимувати коректні результати, є точність роботи обладнання - автоматичних піпеток, термостатів та спектрофотометрів.
Проблеми, які можуть виникнути при проведенні ІФА
| Проблема, що виникає | Можливі причини | Способи усунення проблем |
|---|---|---|
| Високий фон в лунках всього планшету | Забруднений промивач | Почистити головку промивача голкою та промити його 30% розчином етилового спирту, потім дистильованою водою |
| Низька якість або забрунення води | 1. Промити дистилятор 10% розчином соляної кислоти, потім 5 раз дистильованою водою. 2. Використовувати бідистильовану воду. 3. Зберігати дистильовану воду в закритому посуді не довше двох діб. | |
| Використання погано помитого посуду | Використовувати для реагентів окремий посуд, щоденно промивати дистильованою водою, щотижня - хромовою сумішшю або детергентами | |
| Наявність і використання на робочому місці дезрозчинів, що містять хлор | Не використовувати і не зберігати такі дезрозчини | |
| Використання забруднених наконечників | Використовувати чисті наконечники (для кон’югатів і субстрату - одноразові) | |
| Збільшено час інкубації або змінено температурний режим | Дотримуватися режиму інкбації згідно з інструкцією | |
| Високий фон в окремих рядах | Повторне внесення проявника | Розчин проявника вносити один раз |
| Забруднення конусу автоматичної піпетки розчином кон’югату | 1. Прочистити піпетку і обережно набирати рідину, щоб не було "підсосу" розчину. 2. Виділити окремі піпетки для кон’югату | |
| Забруднений один із каналів промивача | Почистити канал промивача, промити вошер | |
| Часті "викиди" (не відтворювані результати) на планшеті | Забруднений промивач | Почистити головку промивача голкою та промити його 30% розчином етилового спирту, потім дистильованою водою |
| Відсутнє забарвлення всього планшету (не працюють контролі) | Неправильно приготований або не внесений один із реагентів (кон’югат або хромоген) | Повторно провести ІФА, звернути увагу на приготування цих реагентів |
| Слабке профарбовування планшету (позитивні контролі нижче вимог інструкції) | Неправильно приготований або не внесений один із реагентів (кон’югат або хромоген) | Повторно провести ІФА, звернути увагу на приготування цих реагентів |
| Скорочено час інкубації з хромогеном | Проводити інкубацію відповідно до інструкції |
