ua ru

Рекомендації щодо проведення ІФА

Коректне проведення імуноферментного аналізу досягається при обов’язковому виконанні наступних вимог:

  1. Якісна підготовка посуду та дистильованої води
  2. Правильна підготовка досліджуваного матеріалу.
  3. Правильна робота з автоматичною піпеткою.
  4. Дотримання пунктів інструкції до тест-системи та умов проведення ІФА:
    • дотримання температурного режиму та часу інкубації
    • якісне промивання планшету на всіх етапах проведення ІФА
    • точність роботи обладнання - піпеток, промивачів, термостатів та спектрофотометрів

Рекомендації щодо якісної підготовки посуду для ІФА

JPEG - 15.6 кб
Рис.1. Окремі ємкості для різних реагентів

Посуд необхідно мити, використовуючи рідкі засоби для миття, які не містять біодобавок. Після миття ретельно ополіскувати посуд проточною, а потім дистильованою водою. Необхідно обов’язково виділяти різні ємкості для роботи з розчинами кон’югатів і проявників (рис. 1). Для маніпуляцій з розчинами кон’югатів та проявників необхідно використовувати одноразові наконечники.

Рекомендації по підготовці досліджуваних зразків

Перед дослідженням в ІФА сироватку можна зберігати протягом 72 годин в холодильнику при 2-80С. Якщо немає можливості дослідити сироватки або плазму протягом зазначеного часу, їх необхідно заморозити при температурі -200С або нижчій.

Зразки сироваток мають бути прозорими, без ознак гемолізу, вираженої гіперліпідемії та бактеріємії.

Для отримання коректного результату при дослідженні сироваток в динаміці захворювання необхідно створити банк сироваток первинного забору, заморожуючи їх при -200С або нижче.

Умови проведення ІФА

JPEG - 43.9 кб
Рис. 2. Заповнення протоколу дослідження

При постановці аналізу температра в приміщенні лабораторії повинна становити 18-250С.

Не допускається наявність в лабораторії парів будь-яких окиснювачів (відкритих ємкостей з розчинами пероксиду водню, гіпохлориду та ін.) та хлорвмісних розчинів.

В процесі проведення ІФА необхідно використовувати якісну дистильовану воду, яка зберігається не довше двох діб.

Недопустимим є повторне використання планшетів тест-систем для будь-якої іншої роботи.

Якісна робота діагностичних наборів гаратнована лише в межах зазначеного терміну придатності за умови дотримання вказаних умов зберігання тест-наборів.

Необхідно обмежити потрапляння прямих сонячних променів на лунки планшету.

Перед початком проведення аналізу необхідно заповнити протокол дослідження (рис. 2)

Якщо при внесенні досліджуваного зразка сталася помилка, наприклад, дві сироватки внесли в одну лунку, таку лунку забраковують. При цьому в схемі внесення зразків необхідно зробити помітку, яка саме лунка містить брак. Час заповнення всіх необхідних лунок не повинен перевищувати 15-20 хв.

Дотримання температурного режиму та часу інкубації

Інкубацію планшету на всіх етапах ІФА проводять при температурі, вказаній в інструкції, при цьому кімнатною вважається температура 18-250С.

Не інкубуйте планшети в термостаті, встановлюючи їх один на один, оскільки нерівномірне прогрівання планшету в цьому випадку призведе до появи крайового ефекту - підвищеного фону по периметру планшету (рис. 3, 4).

JPEG - 11.1 кб
Рис. 3. Неправильне встановлення
JPEG - 17.5 кб
Рис. 4. Правильне встановлення

Основні правила роботи з автоматичною піпеткою

JPEG - 12.7 кб
Рис. 5. Правильне і неправильне положення піпетки

Занурте наконечник на 2-3 мм в біологічну рідину і натисніть на операційну кнопку до першого упору. Не виймаючи наконечник з рідини, обережно відпустіть кнопку в початкове положення. Занурте наконечник на 2-3 мм в розчин, куди необхідно перенести набрану рідину, натисніть кнопку до першого упору. Не змінюючи положення піпетки, плавно відпустіть кнопку до початкового положення. Таким чином наконечник заповниться для перемішування. Повторіть цю процедуру 2-3 рази. Потім натисніть операційну кнопку до другого упору для повного звільнення від рідини. Вийміть наконечник з розчину і відпустіть операційну кнопку до початкового положення. Зніміть наконечник з піпетки за допомогою механізму для зняття наконечників. Замініть наконечник і продовжуйте роботу з наступним зразком біологічної рідини.

Для кращого контролю за внесенням компонентів планшет бажано ставити на білий фон.

При роботі з восьмиканальною піпеткою варто звертати увагу на рівномірність заповнення рідиною всіх наконечників піпетки.

Контрольні і дослідні зразки вносити необхідно обережно, піпетуючи суміш в лунках, при цьому наконечник не повинен торкатися дна лунки.

Промивання планшету

Якісне промивання планшету - один із визначних факторів при проведенні імуноферментного аналізу.

Режим промивання повинен строго відповідати вимогам інструкції. Необхідно слідкувати за рівномірним заповненням всіх лунок планшету, а також звертати увагу, щоб не було перетікання промиваючого розчину з однієї лунки в іншу.

Час експозиції планшету з промиваючим розчином на кожному етапі промивання повинно становити не менше 30 секунд, якщо немає додаткових вимог в інструкції.

Для попередження забруднення промивача (вошера) необхідно щоденно промивати його дистильованою водою, а щотижня - 30% розчином етилового спирту.

Найчастіша причина помилок - забруднення каналів промивача або простору між голками шматочками марлі, вати або кристалами солей.

Розчин проявника безпосередньо перед використанням повинен бути прозорим і безбарвним. Залишки розчину у ванночці рекомендують не виливати до закінчення інкубації планшету з проявником. Проявник, який залишився в ванночці, не повинен змінювати колір протягом 30 хв; поява забарвлення розчину проявника свідчить про його забруднення.

Дуже важливим фактором, який впливає на проведення ІФА і дає можливість отимувати коректні результати, є точність роботи обладнання - автоматичних піпеток, термостатів та спектрофотометрів.

Проблеми, які можуть виникнути при проведенні ІФА

Проблема, що виникаєМожливі причиниСпособи усунення проблем
Високий фон в лунках всього планшету Забруднений промивач Почистити головку промивача голкою та промити його 30% розчином етилового спирту, потім дистильованою водою
Низька якість або забрунення води 1. Промити дистилятор 10% розчином соляної кислоти, потім 5 раз дистильованою водою.
2. Використовувати бідистильовану воду.
3. Зберігати дистильовану воду в закритому посуді не довше двох діб.
Використання погано помитого посуду Використовувати для реагентів окремий посуд, щоденно промивати дистильованою водою, щотижня - хромовою сумішшю або детергентами
Наявність і використання на робочому місці дезрозчинів, що містять хлор Не використовувати і не зберігати такі дезрозчини
Використання забруднених наконечників Використовувати чисті наконечники (для кон’югатів і субстрату - одноразові)
Збільшено час інкубації або змінено температурний режим Дотримуватися режиму інкбації згідно з інструкцією
Високий фон в окремих рядах Повторне внесення проявника Розчин проявника вносити один раз
Забруднення конусу автоматичної піпетки розчином кон’югату 1. Прочистити піпетку і обережно набирати рідину, щоб не було "підсосу" розчину.
2. Виділити окремі піпетки для кон’югату
Забруднений один із каналів промивача Почистити канал промивача, промити вошер
Часті "викиди" (не відтворювані результати) на планшеті Забруднений промивач Почистити головку промивача голкою та промити його 30% розчином етилового спирту, потім дистильованою водою
Відсутнє забарвлення всього планшету (не працюють контролі) Неправильно приготований або не внесений один із реагентів (кон’югат або хромоген) Повторно провести ІФА, звернути увагу на приготування цих реагентів
Слабке профарбовування планшету (позитивні контролі нижче вимог інструкції) Неправильно приготований або не внесений один із реагентів (кон’югат або хромоген) Повторно провести ІФА, звернути увагу на приготування цих реагентів
Скорочено час інкубації з хромогеном Проводити інкубацію відповідно до інструкції