Рекомендации по проведению ИФА
Корректное проведения иммуноферментного анализа достигается при обязательном выполнении следующих требований:
- Качественная подготовка посуды и дистиллированной воды
- Правильная подготовка исследуемого материала.
- Правильная работа с автоматической пипеткой.
- Соблюдение пунктов инструкции к тест-системе и условий проведения ИФА:
- соблюдение температурного режима и времени инкубации
- качественное промывание планшета на всех этапах проведения ИФА
- точность работы оборудования - пипеток, промывателей, термостатов и спектрофотометров
Рекомендации по качественной подготовке посуды для ИФА
- Рис.1. Отдельные емкости для разных реагентов
Посуду необходимо мыть, используя жидкие средства для мытья, не содержащие биодобавок. После мытья тщательно ополаскивать посуду проточной, а затем дистиллированной водой. Необходимо обязательно выделять разные емкости для работы с растворами конъюгатов и проявителей (рис. 1). Для манипуляций с растворами конъюгатов и проявителей необходимо использовать одноразовые наконечники.
Рекомендации по подготовке исследуемых образцов
Перед исследованием в ИФА сыворотку можно хранить в течение 72 часов в холодильнике при 2-8°C. Если нет возможности исследовать сыворотки или плазмы в течение указанного времени, их необходимо заморозить при температуре 20°C или ниже.
Образцы сывороток должны быть прозрачными, без признаков гемолиза, выраженной гиперлипидемии и бактериемии.
Для получения корректного результата при исследовании сывороток в динамике заболевания необходимо создать банк сывороток первичного забора, замораживая их при-20 °C или ниже.
Условия проведения ИФА
- Рис. 2. Заполнение протокола исследования
При постановке анализа температура в помещении лаборатории должна составлять 18-25 °С.
Не допускается наличие в лаборатории паров любых окислителей (открытых емкостей с растворами пероксида водорода, гипохлорита и др.) и хлорсодержащих растворов.
В процессе проведения ИФА необходимо использовать качественную дистиллированную воду, которая хранится не дольше двух суток.
Недопустимо повторное использование планшетов тест-систем для любой другой работы.
Качественная работа диагностических наборов гарантирована только в пределах указанного срока годности при соблюдении указанных условий хранения тест-наборов.
Необходимо ограничить попадание прямых солнечных лучей на лунки планшета.
Перед началом проведения анализа необходимо заполнить протокол исследования (рис. 2)
Если при внесении исследуемого образца произошла ошибка, например, две сыворотки внесли в одну лунку, такую лунку забраковывают. При этом в схеме внесения образцов необходимо сделать пометку, какая именно лунка содержит брак. Время заполнения всех необходимых лунок не должно превышать 15-20 мин.
Соблюдение температурного режима и времени инкубации
Инкубацию планшета на всех этапах ИФА проводят при температуре, указанной в инструкции, при этом комнатной считается температура 18-25°С.
Не инкубируйте планшеты в термостате, устанавливая их один на один, так как неравномерный прогрев планшета в этом случае приведет к появлению краевого эффекта - повышенного фона по периметру планшета (рис. 3, 4).
|
|
Основные правила работы с автоматической пипеткой
- Установите необходимый объем, как указано в инструкции пипетки.
- Убедитесь, что наконечник чистый, а внутри в нем отсутствуют посторонние частицы; плотно наденьте его на конус пипетки.
- Во время работы держите пипетку вертикально (рис. 5).
- Большой палец руки должен лежать на операционной кнопке пипетки.
- Рис. 5. Правильное и неправильное положение пипетки
Погрузите наконечник на 2-3 мм в биологическую жидкость и нажмите на операционную кнопку до первого упора. Не вынимая наконечник из жидкости, осторожно отпустите кнопку в исходное положение. Погрузите наконечник на 2-3 мм в раствор, в который необходимо перенести набранную жидкость, нажмите кнопку до первого упора. Не меняя положения пипетки, плавно отпустите кнопку в исходное положение. Таким образом наконечник заполнится для перемешивания. Повторите эту процедуру 2-3 раза. Нажмите операционную кнопку до второго упора для полного освобождения от жидкости. Выньте наконечник из раствора и отпустите операционную кнопку в исходное положение. Снимите наконечник с пипетки с помощью механизма для снятия наконечников. Замените наконечник и продолжайте работу с последующим образцом биологической жидкости.
Для лучшего контроля за внесением компонентов планшет желательно ставить на белый фон.
При работе с восьмиканального пипеткой следует обращать внимание на равномерность заполнения жидкостью всех наконечников пипетки (рис. 6).
Контрольные и опытные образцы вносить необходимо осторожно, пипетируя смесь в лунках, при этом наконечник не должен касаться дна лунки.
Промывание планшета
Качественное промывание планшета - один из выдающихся факторов при проведении иммуноферментного анализа.
Режим промывки должен строго соответствовать требованиям инструкции. Необходимо следить за равномерным заполнением всех лунок планшета, а также обращать внимание, чтобы не было перетекания промывочного раствора из одной лунки в другую.
Время экспозиции планшета с промывочным раствором на каждом этапе промывки должно составлять не менее 30 секунд, если нет дополнительных требований в инструкции.
Для предупреждения загрязнения промывателя (вошера) необходимо ежедневно промывать его дистиллированной водой, а еженедельно - 30% раствором этилового спирта.
Самая частая причина ошибок - загрязнение каналов промывателя или пространства между иголками кусочками марли, ваты или кристаллами солей.
Раствор проявителя непосредственно перед использованием должен быть прозрачным и бесцветным. Остатки раствора в ванночке рекомендуют не выливать до окончания инкубации планшета с проявителем. Проявитель, оставшийся в ванночке, не должен изменять цвет в течение 30 мин; появление окраски раствора проявителя свидетельствует о его загрязнении.
Очень важным фактором, который влияет на проведение ИФА и позволяет получать корректные результаты, является точность работы оборудования - автоматических пипеток, термостатов и спектрофотометров.