Рекомендации по проведению ИФА

Корректное проведения иммуноферментного анализа достигается при обязательном выполнении следующих требований:

1. Качественная подготовка посуды и дистиллированной воды
2. Правильная подготовка исследуемого материала.
3. Правильная работа с автоматической пипеткой.
4. Соблюдение пунктов инструкции к тест-системе и условий проведения ИФА:
5. соблюдение температурного режима и времени инкубации
6. качественное промывание планшета на всех этапах проведения ИФА
7. точность работы оборудования - пипеток, промывателей, термостатов и спектрофотометров

Рекомендации по качественной подготовке посуды для ИФА

Рис.1. Отдельные емкости для разных реагентов

Посуду необходимо мыть, используя жидкие средства для мытья, не содержащие биодобавок. После мытья тщательно ополаскивать посуду проточной, а затем дистиллированной водой. Необходимо обязательно выделять разные емкости для работы с растворами конъюгатов и проявителей (рис. 1). Для манипуляций с растворами конъюгатов и проявителей необходимо использовать одноразовые наконечники.

Рекомендации по подготовке исследуемых образцов

Перед исследованием в ИФА сыворотку можно хранить в течение 72 часов в холодильнике при 2-8°C. Если нет возможности исследовать сыворотки или плазмы в течение указанного времени, их необходимо заморозить при температуре 20°C или ниже.

Образцы сывороток должны быть прозрачными, без признаков гемолиза, выраженной гиперлипидемии и бактериемии.

Для получения корректного результата при исследовании сывороток в динамике заболевания необходимо создать банк сывороток первичного забора, замораживая их при-20 °C или ниже.

Условия проведения ИФА

Рис. 2. Заполнение протокола исследования

При постановке анализа температура в помещении лаборатории должна составлять 18-25 °С.

Не допускается наличие в лаборатории паров любых окислителей (открытых емкостей с растворами пероксида водорода, гипохлорита и др.) и хлорсодержащих растворов.

В процессе проведения ИФА необходимо использовать качественную дистиллированную воду, которая хранится не дольше двух суток.

Недопустимо повторное использование планшетов тест-систем для любой другой работы.

Качественная работа диагностических наборов гарантирована только в пределах указанного срока годности при соблюдении указанных условий хранения тест-наборов.

Необходимо ограничить попадание прямых солнечных лучей на лунки планшета.

Перед началом проведения анализа необходимо заполнить протокол исследования (рис. 2)

Если при внесении исследуемого образца произошла ошибка, например, две сыворотки внесли в одну лунку, такую ​​лунку забраковывают. При этом в схеме внесения образцов необходимо сделать пометку, какая именно лунка содержит брак. Время заполнения всех необходимых лунок не должно превышать 15-20 мин.

Соблюдение температурного режима и времени инкубации

Инкубацию планшета на всех этапах ИФА проводят при температуре, указанной в инструкции, при этом комнатной считается температура 18-25°С.

Не инкубируйте планшеты в термостате, устанавливая их один на один, так как неравномерный прогрев планшета в этом случае приведет к появлению краевого эффекта - повышенного фона по периметру планшета (рис. 3, 4).

Рис. 3. Неправильное установление

Рис. 4. Правильное установление

Основные правила работы с автоматической пипеткой

• Установите необходимый объем, как указано в инструкции пипетки.
• Убедитесь, что наконечник чистый, а внутри в нем отсутствуют посторонние частицы; плотно наденьте его на конус пипетки.
• Во время работы держите пипетку вертикально (рис. 5).
• Большой палец руки должен лежать на операционной кнопке пипетки.

Рис. 5. Правильное и неправильное положение пипетки

Погрузите наконечник на 2-3 мм в биологическую жидкость и нажмите на операционную кнопку до первого упора. Не вынимая наконечник из жидкости, осторожно отпустите кнопку в исходное положение. Погрузите наконечник на 2-3 мм в раствор, в который необходимо перенести набранную жидкость, нажмите кнопку до первого упора. Не меняя положения пипетки, плавно отпустите кнопку в исходное положение. Таким образом наконечник заполнится для перемешивания. Повторите эту процедуру 2-3 раза. Нажмите операционную кнопку до второго упора для полного освобождения от жидкости. Выньте наконечник из раствора и отпустите операционную кнопку в исходное положение. Снимите наконечник с пипетки с помощью механизма для снятия наконечников. Замените наконечник и продолжайте работу с последующим образцом биологической жидкости.

Для лучшего контроля за внесением компонентов планшет желательно ставить на белый фон.

При работе с восьмиканального пипеткой следует обращать внимание на равномерность заполнения жидкостью всех наконечников пипетки (рис. 6).

Контрольные и опытные образцы вносить необходимо осторожно, пипетируя смесь в лунках, при этом наконечник не должен касаться дна лунки.

Промывание планшета

Качественное промывание планшета - один из выдающихся факторов при проведении иммуноферментного анализа.

Режим промывки должен строго соответствовать требованиям инструкции. Необходимо следить за равномерным заполнением всех лунок планшета, а также обращать внимание, чтобы не было перетекания промывочного раствора из одной лунки в другую.

Время экспозиции планшета с промывочным раствором на каждом этапе промывки должно составлять не менее 30 секунд, если нет дополнительных требований в инструкции.

Для предупреждения загрязнения промывателя (вошера) необходимо ежедневно промывать его дистиллированной водой, а еженедельно - 30% раствором этилового спирта.

Самая частая причина ошибок - загрязнение каналов промывателя или пространства между иголками кусочками марли, ваты или кристаллами солей.

Раствор проявителя непосредственно перед использованием должен быть прозрачным и бесцветным. Остатки раствора в ванночке рекомендуют не выливать до окончания инкубации планшета с проявителем. Проявитель, оставшийся в ванночке, не должен изменять цвет в течение 30 мин; появление окраски раствора проявителя свидетельствует о его загрязнении.

Очень важным фактором, который влияет на проведение ИФА и позволяет получать корректные результаты, является точность работы оборудования - автоматических пипеток, термостатов и спектрофотометров.