Иммуноферментный анализ в диагностике
Современные методы специфической диагностики
Среди методов специфической лабораторной диагностики инфекций выделяют прямые и косвенные.
К прямым методам относятся:
- микроскопический (непосредственное обнаружение инфекционного агента с помощью микроскопа) - световая, флюоресцентная или электронная микроскопия
- вирусологический или бактериологический (выделение инфекционного агента в культуре)
- биологический (выделение инфекционного агента в организме чувствительного животного)
- молекулярно генетический (выявление нуклеиновых кислот возбудителя в различных биожидкостях).
Среди косвенных (серологических) методов чаще всего используются:
- реакция агглютинации (склеивания корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов) антителами в присутствии электролитов - натрия хлорида)
- реакция имунодифузии (диффузия реагентов с образованием видимых преципитатов в геле)
- реакция связывания комплемента (основан на способности иммунного комплекса антиген-антитело связывать комплемент; индикатором в анализе выступают эритроциты и гемолитическая сыворотка)
- радиоиммунный анализ (основанный на применении антигенов или антител, меченых радионуклидом)
- реакция иммунофлюоресценции (связывание специфических антител, меченых флюорохромами, с антигенами тканей и микробами, с последующей регистрацией в УФ-лучах люминесцентного микроскопа)
- иммуноферментный анализ (основан на образовании иммунного комплекса специфических антител и антигена с последующей детекцией иммуноферментным конъюгатом).
Иммуноферментный анализ (ИФА)
ИФА был разработан в 70-х годах ХХ века на пересечении иммунохимии и инженерной энзимологии и является эволюционным продолжением и альтернативой радиоиммунного анализа в последовательности серологических методов диагностики.
На сегодня ИФА занял прочную позицию в диагностике инфекционной патологии человека, животных и растений, в онкологии и эндокринологии. Основными преимуществами ИФА являются:
- высокая чувствительность и специфичность
- воспроизводимость результатов
- простота исполнения
- доступность и стабильность реагентов
- гибкость и возможность модификации конструкций
- экспрессивность и возможность автоматизации для проведения массовых анализов
Весь процесс иммуноферментного анализа можно условно разделить на три основные стадии:
- Формирование специфического комплекса антиген-антитело
- Введение в образовавшийся комплекс метки
- Визуализация метки
С точки зрения способа выполнения все методы ИФА можно разделить на две группы:
- системы, не требующие разделения компонентов (гомогенные методы): если активность меченых молекул, которые связаны с антителами, существенно отличается от активности свободных меченых молекул
- системы, которые требуют разделения (гетерогенные методы): получают две отдельные фракции меченого лиганда - связанную с антителами и свободной, а лишь затем измеряют активность связанных меченых молекул (твердофазный иммуноферментный анализ, ТИФА)
В качестве твердой фазы в ТИФА используют 96-луночные полистироловые планшеты, способные сорбировать макромолекулы. В каждой лунке планшета проводится анализ отдельного образца.
Основные компоненты в ТИФА
Основными компонентами твердофазного ИФА являются: иммуносорбент - адсорбированные на твердой фазе антигены или антитела (в зависимости от целей анализа), иммуноферментный конъюгат - ковалентно сшитые с ферментом специфические антитела или антигены и исследуемый материал - биологические жидкости организма.
В качестве антигенов могут использоваться очищенные нативные антигены микроорганизмов или их аналоги - рекомбинантные белки и синтетические пептиды.
В качестве антител используют поликлональные (пул специфических антител, выделенных из сывороток животных) или моноклональные (моноспецифические антитела, полученные методами клеточной инженерии) антитела.
Иммуноферментные конъюгаты - это ковалентно сшитые молекулы антигенов или антител с ферментом. Одним из биологических феноменов, на котором базируется ИФА, является высокая каталитическая активность ферментов, используемых в качестве индикатора в ИФА.
Основными ферментными метками являются:
- пероксидаза хрена - фермент, который чаще всего используется; содержит углеводородные остатки, которые легко окисляются периодатом и через которые может происходить связывание фермента с антителами или антигеном
- щелочная фосфатаза - очень стабильный, но дорогой фермент
- β-D-галактозидазы - редко используется
- глюкооксидаза - редко используется