Иммуноферментный анализ в диагностике

Современные методы специфической диагностики

Среди методов специфической лабораторной диагностики инфекций выделяют прямые и косвенные.

К прямым методам относятся:

• микроскопический (непосредственное обнаружение инфекционного агента с помощью микроскопа) - световая, флюоресцентная или электронная микроскопия
• вирусологический или бактериологический (выделение инфекционного агента в культуре)
• биологический (выделение инфекционного агента в организме чувствительного животного)
• молекулярно генетический (выявление нуклеиновых кислот возбудителя в различных биожидкостях).

Среди косвенных (серологических) методов чаще всего используются:

• реакция агглютинации (склеивания корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов) антителами в присутствии электролитов - натрия хлорида)
• реакция имунодифузии (диффузия реагентов с образованием видимых преципитатов в геле)
• реакция связывания комплемента (основан на способности иммунного комплекса антиген-антитело связывать комплемент; индикатором в анализе выступают эритроциты и гемолитическая сыворотка)
• радиоиммунный анализ (основанный на применении антигенов или антител, меченых радионуклидом)
• реакция иммунофлюоресценции (связывание специфических антител, меченых флюорохромами, с антигенами тканей и микробами, с последующей регистрацией в УФ-лучах люминесцентного микроскопа)
• иммуноферментный анализ (основан на образовании иммунного комплекса специфических антител и антигена с последующей детекцией иммуноферментным конъюгатом).

Иммуноферментный анализ (ИФА)

ИФА был разработан в 70-х годах ХХ века на пересечении иммунохимии и инженерной энзимологии и является эволюционным продолжением и альтернативой радиоиммунного анализа в последовательности серологических методов диагностики.

На сегодня ИФА занял прочную позицию в диагностике инфекционной патологии человека, животных и растений, в онкологии и эндокринологии. Основными преимуществами ИФА являются:

• высокая чувствительность и специфичность
• воспроизводимость результатов
• простота исполнения
• доступность и стабильность реагентов
• гибкость и возможность модификации конструкций
• экспрессивность и возможность автоматизации для проведения массовых анализов

Весь процесс иммуноферментного анализа можно условно разделить на три основные стадии:

• Формирование специфического комплекса антиген-антитело
• Введение в образовавшийся комплекс метки
• Визуализация метки

С точки зрения способа выполнения все методы ИФА можно разделить на две группы:

• системы, не требующие разделения компонентов (гомогенные методы): если активность меченых молекул, которые связаны с антителами, существенно отличается от активности свободных меченых молекул
• системы, которые требуют разделения (гетерогенные методы): получают две отдельные фракции меченого лиганда - связанную с антителами и свободной, а лишь затем измеряют активность связанных меченых молекул (твердофазный иммуноферментный анализ, ТИФА)

В качестве твердой фазы в ТИФА используют 96-луночные полистироловые планшеты, способные сорбировать макромолекулы. В каждой лунке планшета проводится анализ отдельного образца.

Основные компоненты в ТИФА

Основными компонентами твердофазного ИФА являются: иммуносорбент - адсорбированные на твердой фазе антигены или антитела (в зависимости от целей анализа), иммуноферментный конъюгат - ковалентно сшитые с ферментом специфические антитела или антигены и исследуемый материал - биологические жидкости организма.

В качестве антигенов могут использоваться очищенные нативные антигены микроорганизмов или их аналоги - рекомбинантные белки и синтетические пептиды.

В качестве антител используют поликлональные (пул специфических антител, выделенных из сывороток животных) или моноклональные (моноспецифические антитела, полученные методами клеточной инженерии) антитела.

Иммуноферментные конъюгаты - это ковалентно сшитые молекулы антигенов или антител с ферментом. Одним из биологических феноменов, на котором базируется ИФА, является высокая каталитическая активность ферментов, используемых в качестве индикатора в ИФА.

Основными ферментными метками являются:

• пероксидаза хрена - фермент, который чаще всего используется; содержит углеводородные остатки, которые легко окисляются периодатом и через которые может происходить связывание фермента с антителами или антигеном
• щелочная фосфатаза - очень стабильный, но дорогой фермент
• β-D-галактозидазы - редко используется
• глюкооксидаза - редко используется