Імуноферментний аналіз в діагностиці

Сучасні методи специфічної діагностики

Серед методів специфічної лабораторної діагностики інфекцій виділяють прямі та непрямі.

До прямих методів відносять:

• мікроскопічний (безпосереднє виявлення інфекційного агенту за допомогою мікроскопу) - світлова, флюоресцентна або електронна мікроскопія
• вірусологічний або бактеріологічний (виділення інфекційного агенту в культурі)
• біологічний (виділення інфекційного агенту в організмі чутливої тварини)
• молекулярно генетичний (виявлення нуклеїнових кислот збудника в різноманітних біорідинах).

Серед непрямих (серологічних) методів найчастіше використовуються:

• реакція аглютинації (склеювання корпускулярних антигенів (бактерій,еритроцитів) антитілами в присутності електролітів - хлориду натрію)
• реакція імунодифузії (дифузія реагентів з утворенням видимих преципітатів в гелі)
• реакція зв’язування комплементу (базується на здатності імунного комплексу антиген-антитіло зв’язувати комплемент; індикатором в аналізі виступають еритроцити та гемолітична сироватка)
• радіоімунний аналіз (базується на застосуванні антигенів або антитіл, мічених радіонуклідом)
• реакція імунофлюоресценції (зв’язування специфічних антитіл, мічених флюорохромами, з антигенами тканин та мікробами, з наступною реєстрацією в УФ-променях люмінесцентного мікроскопу)
• імуноферментний аналіз (базується на утворенні імунного комплексу специфічних антитіл та антигену з наступною детекцією імуноферментним кон’югатом.

Імуноферментний аналіз (ІФА)

ІФА було розроблено в 70-х роках ХХ століття на перетині імунохімії та інженерної ензимології та являється еволюційним продовженням і альтернативою радіоімунному аналізу в послідовності серологічних методів діагностики.

На сьогодні ІФА зайняв міцну позицію в діагностиці інфекційної патології людини, тварин та рослин, в онкології та ендокринології. Основними перевагами ІФА є:

• висока чутливість і специфічність
• відтворюваність результатів
• простота виконання
• доступність та стабільність реагентів
• гнучкість та можливість модифікації конструкцій
• експресивність та можливість автоматизації для проведення масових аналізів

Весь процес імуноферментного аналізу можна умовно поділити на три основні стадії:

• Формування специфічного комплексу антиген-антитіло
• Введення в утворений комплекс мітки
• Візуалізація мітки

З точки зору способу виконання всі методи ІФА можна розділити на дві групи:

• системи, що не потребують розділення компонентів (гомогенні методи): якщо активність мічених молекул, які зв’язані з антитілами, суттєво відрізняється від активності вільних мічених молекул
• системи, які потребують розділення (гетерогенні методи): отримують дві окремі фракції міченого ліганда - зв’язану з антитілами і вільну, а лише потім вимірюють активність зв’язаних мічених молекул (твердофазний імуноферментний аналіз, ТІФА)

В якості твердої фази в ТІФА використовують 96-лункові полістиролові планшети, які здатні сорбувати макромолекули. В кожній лунці планшету проводиться аналіз окремого зразку.

Основні компоненти в ТІФА

Основними компонентами твердофазного ІФА є: імуносорбент - адсорбовані на твердій фазі антигени або антитіла (залежно від цілей аналізу), імуноферментний кон’югат - ковалентно зшиті з ферментом специфічні антитіла або антигени та досліджуваний матеріал - біологічні рідини організму.

В якості антигенів можуть використовуватися очищені нативні антигени мікроорганізмів або їх аналоги - рекомбінантні білки та синтетичні пептиди.

В якості антитіл використовують поліклональні (пул специфічних антитіл, виділених з сироваток тварин) або моноклональні (моноспецифічні антитіла, отримані методами клітинної інженерії) антитіла.

Імуноферментні кон’югати - це ковалентно зшиті молекули антигенів або антитіл з ферментом. Одним із біологічних феноменів, на якому базується ІФА, являється висока каталітична активність ферментів, які використовуються в якості індикатора в ІФА.

Основними ферментними мітками є:

• пероксидаза хрону - фермент, що найчастіше використовується; містить вуглеводні залишки, що легко окиснюються періодатом, через які може відбуватися зв’язування ферменту з антитілами або антигеном
• лужна фосфатаза - дуже стабільний, але дорогий фермент
• β-D-галактозидаза - рідко використовується
• глюкооксидаза - рідко використовується

Основні варіанти ТІФА

Непрямий ТІФА

ТІФА на основі IgM-захвату

"Сендвіч"-ТІФА

Комбінований IgM-захват

Конкурентний ТІФА